蛋白定量是生物學(xué)實驗中的一個關(guān)鍵步驟，用于確定蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)定量對于驗證細胞裂解是否成功、比較不同樣品、標(biāo)準(zhǔn)化保存以及確保標(biāo)記反應(yīng)在適當(dāng)化學(xué)濃度下進行都至關(guān)重要。
目前常見的蛋白質(zhì)定量方法包括：
1. 紫外分光光度法：
原理：基于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸在280 nm處的吸收特性。
優(yōu)點：操作簡便、迅速，不消耗樣品。
缺點：需要標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為參考，且核酸的存在會影響結(jié)果。
2. 雙縮脲法：
原理：蛋白質(zhì)在強堿性溶液中與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
優(yōu)點：簡單，適用于測定110 mg蛋白質(zhì)。
缺點：靈敏度較低，不適用于微量蛋白質(zhì)的測定。
3. 考馬斯亮藍法（Bradford法）：
原理：蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G250結(jié)合，引起最大吸收峰從465 nm轉(zhuǎn)移到595 nm。
優(yōu)點：快速、靈敏度高。
缺點：受表面活性劑影響，且不同蛋白質(zhì)之間的差異較大。
4. BCA法：
原理：蛋白質(zhì)在堿性條件下將Cu2+還原為Cu1+，后者與BCA形成藍色復(fù)合物，吸光度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。
優(yōu)點：靈敏度ji高，兼容表面活性劑。
缺點：受銅離子螯合劑和還原劑的影響，孵育時間較長。
5. Folin酚試劑法（Lowry法）：
原理：蛋白質(zhì)與Folin酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化，用于測定蛋白質(zhì)濃度。
優(yōu)點：較為敏感。
缺點：操作復(fù)雜，需要較長的反應(yīng)時間。
在選擇蛋白質(zhì)定量方法時，需要考慮實驗的具體需求，包括靈敏度、與樣品中常見物質(zhì)的相容性、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度以及蛋白質(zhì)間的差異。例如，BCA法和考馬斯亮藍法（Bradford法）因其操作簡便和高靈敏度，常用于實驗室中的蛋白質(zhì)定量。紫外分光光度法則適用于純化后的蛋白濃度測定。
