實時定量PCR（RT-qPCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過熒光化學(xué)物質(zhì)測量每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，常用于定量分析特定DNA序列。
RT-qPCR的實驗操作流程：
1、引物設(shè)計：引物設(shè)計需遵循一般原則，產(chǎn)物長度應(yīng)控制在80-150bp，以保證擴(kuò)增效率和特異性。
RNA提?。禾崛〖?xì)胞總RNA，包括清洗、裂解、分離和沉淀RNA步驟。
2、RNA濃度測定：使用如Nano drop等儀器測定RNA濃度。
3、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：使用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)換為cDNA，作為qPCR的模板。
4、qPCR反應(yīng)體系配置：實驗通常使用2×濃縮的real-time qPCR MasterMix。需要加入模板和引物。每個樣品至少做3個平行孔，以確保數(shù)據(jù)的可統(tǒng)計性。
5、上機(jī)操作：將配置好的反應(yīng)液放入實時qPCR儀中，設(shè)置相應(yīng)的溫度循環(huán)和采集模式，進(jìn)行擴(kuò)增檢測。real-time qPCR不需要常規(guī)PCR的三步法（變性、退火、延伸）。 由于產(chǎn)物長度短（80-150 bp），通常只需要變性和退火步驟。 使用SYBR Green等染料時，PCR后應(yīng)加溶解程序以形成溶解曲線，判斷特異性擴(kuò)增。
6、數(shù)據(jù)分析：通過擴(kuò)增曲線和融解曲線分析，可進(jìn)行相對定量或絕對定量分析。相對定量用于比較靶基因在不同樣本中的表達(dá)差異，絕對定量用于測定樣本中靶基因的確切拷貝數(shù)。
7、常見問題分析：注意MasterMix不要反復(fù)凍融，常使用時可溶解后存放于4°C。 配制時應(yīng)在冰上操作，每管或每孔換新槍頭，避免加樣誤差。 如無Ct值出現(xiàn)、Ct值出現(xiàn)過晚、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳、負(fù)對照有信號、溶解曲線異常、擴(kuò)增效率低等問題，需針對具體情況進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。
